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  • 免疫共沉淀


    一、实验原理

    免疫共沉淀是利用抗原和抗体的特异性结合以及细菌的Protein G或A能特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的方法。其基本原理是在细胞裂解液中加入感兴趣蛋白的抗体,孵育后再加入与抗体特异结合的结合于磁珠的Protein G或A,若细胞中存在与兴趣蛋白相结合的目的蛋白,就可以形成蛋白复合物:“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein G或A”;最后通过免疫印迹实验来检测目的蛋白。

    当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X,那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。Co-IP确定的存在相互作用关系,但这种相互作用并不能确定使用直接作用还是间接作用。

    1) 免疫共沉淀的优点

    1.  相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的,处于天然状态。

    2.  蛋白的相互作用是在自然状态下进行的,可以避免人为的影响。

    3.  可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

    2) 免疫共沉淀的缺点

    1.  可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质-蛋白质相互作用;

    2.  两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用;

    3.  必须在实验前预测目的蛋白是什么,以选择最后检测的抗体,所以,若预测不正确,实验就得不到结果,方法本身具有冒险性。


    二、应用简介

    Co-IP、ChIP、RIP、Pulldown作为常见的分子互作验证方法。它们可以从检验的出发点来区分:co-IP、ChIP、RIP是利用已知的蛋白检测体内相关蛋白、DNA、RNA,并通过蛋白抗体免疫沉淀分离目标蛋白、DNA、RNA。Pulldown则是根据已知RNA(RNA pulldown)或者已知蛋白(GST pulldown)体外检验相关蛋白。

    Co-IP主要用于检测蛋白质与蛋白质之间相互作用,是IP实验的一种扩展, 基于IP反应的潜力,在样品溶液中捕获和纯化主要目标(抗原等)及通过天然相互作用靶标结合的其他的大分子。此外,还可以利用Co-IP来确定在不同条件下的蛋白质相互作用。


    三、 实验方法 


    四、样本送检要求


    五、案例展示

     


    六、常见问题

    1、实验样品制备方法准备:很重要!根据研究目的,检测样品可能是组织样品,也可能是细胞样品,不同样品制备流程不太相同,目的蛋白表达量也有较大差别,必须选择合适的样品和样品制备方法。

    2、根据研究目的选择适合的蛋白特异性抗体:非常重要!用于Co-IP实验的抗体是针对目的蛋白的特异性抗体,最理想的是选择一种能识别兴趣蛋白质某个表位的抗体,且这个表位不会被任何其他蛋白质相互作用所掩盖,比普通WB抗体要求高出很多;同时,抗体特异性和灵敏性尽可能高,才有可能有干净的背景和较好的IP效果,所以必须选择最适合的抗体用于Co-IP实验。

    3、未检测到目得蛋白或蛋白很少:


    4、目得蛋白高背景:

     


    七、服务流程

    
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