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    一、实验原理

    Southern blot又称凝胶电泳压印杂交技术,该方法利用硝酸纤维膜或滤纸或尼龙膜等具有吸附DNA的功能,先将DNA片段作凝胶电泳,并将电泳后的DNA区带吸附到膜上,然后直接在膜上进行同位素标记探针与被测DNA之间的杂交,最后通过放射自显影对杂交结果进行检测,以此探测一个DNA样品中含有的特定DNA序列。

    Southern杂交技术是由Edward M. Southern在1975年首先发明的用于检测DNA的一种核酸杂交技术,并因此而得名。其原理是根据毛细管作用的原理,将在电泳凝胶中分离的DNA片段转移并结合在适当的滤膜上,然后通过与标记的单链DNA或RNA探针的杂交作用,检测这些被转移的DNA片段。

    主要步骤包括将基因组DNA进行限制性内切酶消化,琼脂糖凝胶电泳分离,经碱变性等预处理之后,平铺在已用电泳缓冲液饱和了的两张滤纸上,在凝胶上部覆盖一张硝酸纤维素滤膜,接着加一叠干滤纸,然后再压盖一重物。由于干滤纸的吸引作用,凝胶中的单链DNA便随电泳缓冲液一起转移。这些DNA分子一旦与硝酸纤维素滤膜接触,便会牢牢地与之结合,而且是严格按照它们在凝胶中的谱带模式,原样地被吸印到滤膜上。在80℃下烘烤12h,DNA片段就会被稳定地固定在硝酸纤维素滤膜上。然后将此滤膜移放在加有标记探针的溶液中进行核酸杂交,漂洗去游离的没有杂交上的探针分子,用适当的方式显色,与溴化乙锭染色的凝胶谱带作对照比较,便可鉴定出与探针具有同源性的限制片段的大小和位置。


    二、应用简介

    技术应用

    1、定性及定量分析基因组中特定基因;

    2、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析。

    应用范围

    1.遗传病诊断:传统的基因诊断技术主要是以基因探针技术为基础而建立的一些检测方法-Southern blot。

    2.DNA图谱分析:a.高度的特异性;b.稳定的遗传性;c.体细胞稳定性

    3.检测样品中的DNA及其含量

    4.PCR产物分析


    三、 实验方法

     


    四、样本送检要求


    五、案例展示


    六、常见问题

    1、针对不同的实验材料,southern杂交实验难度有差异么?

    答:不同的实验材料,在进行试验过程中难度差异很大,例如玉米、小麦、葡萄的Southern杂交检测难度要比普通的材料要大。

    (1)、物种本身的基因组较大(例如小麦),检测操作难度大

    (2)、材料本身含有高糖多酚(例如葡萄)严重影响酶切操作

    (3)、物种品系复杂(例如玉米),在基因组信息研究层面还不透彻。

    2、核酸质量对southern杂交实验的影响

    答:核酸质量对实验的影响是直接的,既要求客户提供的总量足够——实验消耗(上样量),又要求保证质量——按要求准备材料。
        上样量指的是基因组DNA酶切消化后,回收后的DNA片段的量。根据不同物种的基因组大小不同,上样量也有所区别。基因组越大,上样量越多。例如,拟南芥大概需要3ug,酵母3ug,人8ug,小麦15ug。酶切消化之后不能直接上样,需要回收纯化。回收会有损失,最多能损失一半,所以需要客户提供足够量的样品,一般要求至少20 ug的基因组DNA。(以上上样量均为一个泳道)
        DNA样品一般对OD值和浓度有如下要求:OD260/280=1.8~2.0,OD260/230>2.0,浓度≥100 ng/ul。同时,需要对DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳,电泳结果显示该DNA样品无蛋白质和RNA等物质污染,无降解弥散,条带清晰。

    3、探针设计是怎么回事,有哪些原则?

    答:探针就是与待测目的基因序列同源的一段地高辛标记的DNA序列,可以和酶切后的基因组片段特异性的结合。 探针设计有如下几个原则:

    (1)、长度适中。探针的片段长度一般控制在300-1000bp,探针太长时会导致非特异性结合的概率增加,探针太短时,探针结合的地高辛标记物太少,会导致发光信号减弱。

    (2)、特异性强。最佳的探针序列是仅与目的基因同源,与整个基因组序列的同源片段低于30%。

    (3)、ATGC含量均匀,无发卡结构和高度重复序列。

    4、基因组片段化时使用限制性内切酶是怎么选择的?

    答:(1)、目的基因序列中不能含有该位点

    (2)、常用的内切酶,价格优惠、酶切效率高 

    (3)、预实验可以把基因组片段化,电泳检测弥散状态看不到明显的主带。

    (4)、根据转化载体上的酶切位点选择

    5、如何减少非特异的曝光条带?

    我们采用PCR法合成双链的地高辛标记的探针,电泳检测探针是否标记成功,若条带单一,且略大于对照组,则认为探针合成成功(如图3所示)。
       此外,和合成探针前,需要在NCBI上比对探针序列,若没有在待测物种中Blast到高同源性的序列,则认为该探针是特异的。

    6、检测结果阴性有哪些因素造成的?

    答:在southern杂交服务中,大概总结为一下几类原因:

    (1)、基因组中目的基因丰度很低,低于southern blot杂交实验的检测下限(目的基因的量低于0.1pg)

    (2)、在该物种基因组信息不全的状态下,探针序列特异性很难保证,结果出现大量的非特异性条带。

    (3)、基因组质量达不到要求 

    (4)、待测样品的确为阴性

    (5)、酶切方案的影响


    七、服务流程

    
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